技術文章
TECHNICAL ARTICLES我們在做免疫熒光(IF),激光共聚焦(Confocal),凋亡檢測(TUNEL)時,免不了要制備細胞爬片,爬片質量*決定了最后拍照的質量以及實驗數(shù)據(jù)的精準性。今天,就教大家如何制備好的細胞爬片。
一. 實驗材料及試劑
蓋玻片、培養(yǎng)板、酒精燈、鑷子等;75%乙醇、DMEM*培養(yǎng)基(RPMI-1640*培養(yǎng)基)、胰酶等。
二、實驗內容
爬片準備:
1、24*24蓋玻片,剛好用于6孔板。也可用更大的蓋玻片,放在大的培養(yǎng)皿中爬片。
2. 蓋玻片泡酸過夜,第二天先用自來水沖洗20遍,再置于無水酒清中浸泡6小時,再用三蒸水沖洗3遍(個人認為主要目的是將酸沖洗干凈就可以了,如果不干凈的話,細胞帖壁不好),放在飯盒或者玻璃培養(yǎng)皿中烘干后進行高壓消毒、烤干。
3.蓋玻片浸泡75%乙醇10分鐘消毒,然后酒精燈上烤干,直接放入培養(yǎng)皿,開始種細胞。重點是玻片是干凈的、無菌的。
4.蓋玻片在液體中經(jīng)常有貼壁吸附力,用一般鑷子很難一次性夾起,將注射器針頭針尖向背面弄個小鉤,這樣將爬片輕輕勾起,用小鑷子取出就可以。
細胞進行爬片:
1. 胰酶消化細胞后計數(shù)重懸細胞于*培養(yǎng)基中(懸浮細胞直接離心)。
2. 加細胞時,根據(jù)玻片的大小,先在每個孔里準備放爬片的位置滴少量培養(yǎng)基,目的是使玻片與培養(yǎng)皿靠培養(yǎng)基的張力粘合到一起,然后放玻片,防止加細胞懸液時玻片漂起,造成雙層細胞貼片。整個過程注意無菌操作。
3. 根據(jù)自己的需要選擇合適的細胞密度種入培養(yǎng)板內即可
保存細胞爬片時,一般用培養(yǎng)皿或避光濕盒,先在皿底放一層面巾紙,然后再放爬片,這樣方便做實驗時取片。然后蓋上蓋子,并在蓋子上做標記,為避免混淆。一般-20℃保存2-3月的片子去拍照沒有問題的。制備好的細胞爬片是不是很簡單呢?
三、注意事項
1. 使用細胞爬片時(比如在六孔板中放入爬片,六孔板的孔底面積往往會比爬片面積多出一部分,加細胞懸液時常常就是細胞鋪滿整個孔底,有時細胞生長邊集現(xiàn)象,就是靠近壁邊緣密度要高些,這樣處于中央玻片上爬的細胞數(shù)量就可能相對較少)。比較好的做法是將玻片放入孔板的孔內后,加細胞懸液時只滴到玻片上,一直滴到液體布滿整個玻片又不會溢出玻片邊緣。
2. 按照實驗設計,作用一定時間后取玻片。注意細胞不能太密,否則容易掉片。
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