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常見問題之影響蛋白表達(dá)因素有哪些？

1.蛋白本身的特性：蛋白分子量大小、蛋白來源/物種、是否為毒性蛋白，蛋白翻譯后修飾程度、蛋白自身結(jié)構(gòu)的復(fù)雜程度2.宿主的選擇：宿主本身的特性、蛋白表達(dá)需求等都影響著蛋白表達(dá)3.蛋白需求量：蛋白應(yīng)用范圍對應(yīng)的需求量不同，所以要根據(jù)需求量確定表達(dá)系統(tǒng)4.質(zhì)粒載體的選擇：載體是攜帶外源基因的工具，要根據(jù)系統(tǒng)選擇合適的載體才能使蛋白更好的表達(dá)5.融合標(biāo)簽的選擇：蛋白重組表達(dá)過程中采用親和標(biāo)簽融合表達(dá)有兩方面的作用：一方面是為了使蛋白純化過程變得更加容易；另一方面是為了促進(jìn)某些不溶性蛋...

常見問題之HIS標(biāo)簽蛋白沒有被洗脫下來

蛋白掛柱后洗脫不下來主要是因為蛋白和柱子結(jié)合能力太強(qiáng)或者洗脫條件太溫和，我們可以從以下幾方面考慮解決問題。1、洗脫條件太溫和：重新摸索洗脫條件，增加緩沖液中咪唑濃度或者適當(dāng)降低緩沖液pH以確定最佳的洗脫條件或者更、換緩沖液的成分（換成tris-HCl緩沖液）。2、蛋白在柱子中沉淀：適當(dāng)降低上樣量或蛋白濃度，用咪唑線性洗脫。使用添加劑或者改變NaCl的濃度，或者在變性的條件下洗脫（加4-8M的尿素或者4-6M的鹽酸胍）。3、非特異性的疏水或者其他作用：在洗脫液中加非離子的添加劑...

慢病毒構(gòu)建原理

慢病毒載體（Lentivirus）是一類改造自人免疫缺陷病毒（HIV）的病毒載體，是逆轉(zhuǎn)錄病毒的一種，基因組是RNA，其毒性基因已經(jīng)被剔除并被外源性目的基因所取代，屬于假型病毒。可利用逆轉(zhuǎn)錄酶將外源基因整合到基因組中實現(xiàn)穩(wěn)定表達(dá)，具有感染分裂期與非分裂期細(xì)胞的特性?！袈《净蚪M進(jìn)入細(xì)胞后，在細(xì)胞漿中反轉(zhuǎn)錄為DNA，形成DNA整合前復(fù)合體，進(jìn)入細(xì)胞核后，DNA整合到細(xì)胞基因組中。整合后的DNA轉(zhuǎn)錄成mRNA，回到細(xì)胞漿中，表達(dá)目的蛋白；或產(chǎn)生小RNA。慢病毒介導(dǎo)的基因表達(dá)或小...

帶你學(xué)會一種藥物研究利器——等溫滴定量熱法

等溫滴定量熱法(IsothermalTitrationCalorimetry,ITC)是近年來發(fā)展起來的一種研究生物熱力學(xué)與生物動力學(xué)的重要方法，它通過高靈敏度、高自動化的微量量熱儀連續(xù)、準(zhǔn)確地監(jiān)測和記錄一個變化過程的量熱曲線，原位、在線和無損傷地同時提供熱力學(xué)和動力學(xué)信息。ITC檢測方式與化學(xué)反應(yīng)中的酸堿滴定法相似，在ITC測定中，首先將一種反應(yīng)物置于一個溫控樣品池中，并通過一個熱電偶回路與一個參比池相偶聯(lián)，樣品池和參比池處于相同的外部環(huán)境。特定的滴定劑（按實驗需要選擇）定...

NK細(xì)胞是屬于什么細(xì)胞呢？

NK（自然殺傷細(xì)胞）通過整合識別MHCI分子的激活和抑制類受體的信號對靶點進(jìn)行識別，對靶細(xì)胞進(jìn)行直接殺傷，同時不損傷自身健康細(xì)胞。人體NK細(xì)胞占血液和其他部位中淋巴細(xì)胞的5%-20%，含量豐富，在抗病毒和抗腫瘤免疫中發(fā)揮關(guān)鍵作用。NK是控制急性和慢性病毒感染所必需的，同時NK能夠促進(jìn)多種腫瘤直接裂解，在不同部位巡邏防止轉(zhuǎn)移。NK細(xì)胞功能的多面性顯示出其在免疫介導(dǎo)的保護(hù)和內(nèi)環(huán)境穩(wěn)態(tài)平衡中具有動態(tài)作用。根據(jù)CD56和抗體結(jié)合Fc受體CD16的表達(dá)水平，人類NK可細(xì)分為成熟度和功能...

抗痩素納米抗體制備及篩選

瘦素是一種與能量代謝、免疫、生殖等相關(guān)的多功能細(xì)胞因子，其在血液中的含量異常會導(dǎo)致肥胖、營養(yǎng)不良、心血管疾病、腫瘤、肝病等多種疾病，特別是終末期腎衰患者廣泛存在瘦素水平過高的問題，由此導(dǎo)致腎衰癥患者營養(yǎng)不良、高血壓、胰島素抵抗等并發(fā)癥，這些并發(fā)癥嚴(yán)重影響了患者的生活質(zhì)量，因此開發(fā)特異性抗體實現(xiàn)瘦素水平的檢測與去除將具有非常重要的臨床意義。納米抗體由于其諸多優(yōu)良特點，成為該方面研究的選擇。獲得足夠量的抗原是進(jìn)行抗體篩選的前提，由于血液中瘦素含量較低，進(jìn)行了瘦素的制備，然后進(jìn)行抗...

為什么大多數(shù)細(xì)胞培養(yǎng)需要二氧化碳培養(yǎng)箱

細(xì)胞培養(yǎng)基的pH一般在7.0-7.4之間。由于碳酸鹽pH緩沖體系是一種生理pH緩沖體系(是人體血液中最重要的pH緩沖體系)，大多數(shù)培養(yǎng)基都是用它來維持穩(wěn)定的pH值，用粉末配制培養(yǎng)液時，往往需要加入一定量的碳酸氫鈉。對于大多數(shù)以碳酸鹽作為pH緩沖體系的培養(yǎng)液，為了維持穩(wěn)定的pH，培養(yǎng)箱中的二氧化碳需要維持在2-10%之間，以維持培養(yǎng)液中溶解的二氧化碳濃度。同時，用于細(xì)胞培養(yǎng)的容器需要一定程度的通風(fēng)，以便于氣體的交換。使用其他pH緩沖系統(tǒng)是否不需要二氧化碳培養(yǎng)箱？已經(jīng)發(fā)現(xiàn)，由于空...

警惕！細(xì)胞系的交叉污染可能是毀掉你實驗的元兇

您是否有過這樣的經(jīng)歷……新買到的細(xì)胞或者實驗室傳了幾代的細(xì)胞，又或者是儲存于超低溫冰箱幾年不用的細(xì)胞，需要用到時腦海里一直有著這樣的問題困擾著你，被污染了么?鑒定正確么？用它做研究會影響實驗結(jié)果么?據(jù)統(tǒng)計約30%細(xì)胞系被交叉污染或錯誤辨識，只因使用了交叉污染或錯誤辨識的細(xì)胞而導(dǎo)致研究結(jié)論錯誤、結(jié)果不可重復(fù)、臨床細(xì)胞治療災(zāi)難性后果……，這將浪費大量時間、精力和金錢。世人皆知，細(xì)胞身嬌體貴難養(yǎng)活，養(yǎng)好細(xì)胞實屬不易。而這其中最煩的是污染、最怕的是掉包。因為盡管研究僧們有方法把一切污...