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ARTICLES凡是來源于胚胎、組織器官及外周血,經(jīng)特殊分離方法制備而來的原初培養(yǎng)的細(xì)胞稱之為原代細(xì)胞。人或動(dòng)物體內(nèi)(或胚胎組織)由于多種細(xì)胞結(jié)合緊密,不利于各個(gè)細(xì)胞在體外培養(yǎng)中生長繁殖,必須將現(xiàn)有的組織塊充分散開,使細(xì)胞解離出來。
免疫共沉淀(Co-Immunoprecipitation)是以抗體和抗原之間的專一性作用為基礎(chǔ)的用于研究蛋白質(zhì)相互作用的經(jīng)典方法。是確定兩種蛋白質(zhì)在完整細(xì)胞內(nèi)生理性相互作用的有效方法。
酶聯(lián)免疫吸附測(cè)定enzyme linked immunosorbent assay(ELISA)指將可溶性的抗原或抗體結(jié)合到聚苯乙烯等固相載體上,利用抗原抗體結(jié)合專一性進(jìn)行免疫反應(yīng)的定性和定量檢測(cè)方法。分為夾心法,間接法和競爭法三種。
ChiRP(Chromatin Isolation by RNA Purification )是一種檢測(cè)與RNA綁定的DNA和蛋白相互作用的方法。該方法是通過設(shè)計(jì)生物素或鏈霉親和素探針,把目標(biāo)RNA拉下來以后,與其共同作用的DNA染色體片段就會(huì)附在到磁珠上,后通過qRT-PCR、測(cè)序、免疫印跡法和質(zhì)譜分析等確定目的RNA、DNA和RNA結(jié)合蛋白(RBPs)。
研究DNA結(jié)合蛋白與其靶DNA之間相互作用的主要實(shí)驗(yàn)手段之一。原理及流程如下: 鏈親和素磁珠能夠與生物素標(biāo)記DNA/蛋白復(fù)合物結(jié)合。在磁場(chǎng)下或通過離心使結(jié)合物與上清液分離,吸棄上清液并洗滌磁珠,然后用SDS樣品液使蛋白變性而與磁珠分離。分離液中的蛋白質(zhì)用SDS 聚丙烯酰胺凝膠電泳(PAGE)或雙向電泳分離,SDS PAGE用高靈敏度考馬斯亮藍(lán)(CBB)染色。然后從染色膠上切下所需蛋白帶進(jìn)行質(zhì)
RNA pull down實(shí)驗(yàn) 檢測(cè)RNA結(jié)合蛋白與其靶RNA之間的相互作用。使用體外轉(zhuǎn)錄法標(biāo)記生物素RNA探針,然后與胞漿蛋白提取液孵育,形成RNA-蛋白質(zhì)復(fù)合物。該復(fù)合物可與鏈親和素標(biāo)記的磁珠結(jié)合,從而與孵育液中的其他成分分離。復(fù)合物洗脫后,通過western blot實(shí)驗(yàn)檢測(cè)特定的RNA結(jié)合蛋白是否與RNA相互作用。
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