抗體人源化簡介

抗體人源化改造是增加異源抗體中人源序列比率的過程。隨著雜交瘤技術(shù)的發(fā)展，大批的與抗原有特異親和力的異源（通常是鼠源）抗體引起了人們的興趣，但是由于HAMA效應(yīng)的存在，大大限制了這些抗體在臨床上的應(yīng)用。而且這些異源抗體往往半衰期短，且能引起機(jī)體的炎癥效應(yīng)?？贵w人源化的過程就是解決異源單克隆抗體免疫原性，改善抗體對人體免疫系統(tǒng)的活化作用。

艾柏森生物擁有豐富的抗體人源化經(jīng)驗，我們利用多種策略進(jìn)行抗體的人源化改造，可以在保留抗體特異性的同時，大部分或者全部消除異源抗體在人體內(nèi)的免疫原性。其中包括重構(gòu)抗體、鏈替換抗體及表面重塑抗體等，通過建立噬菌體展示的人源化突變庫，篩選出高親和力的人源化抗體，也可以通過哺乳動物細(xì)胞表面展示技術(shù)建立人源化的IgG庫，通過FACS分類篩選。

艾柏森生物人源化服務(wù)基本流程：

抗體測序——同源建模——CDR移植——設(shè)計改造

服務(wù)流程：

技術(shù)流程：

艾柏森生物提供多樣化的策略，包括：

抗體人源化策略：CDR&SDR移植、鏈替換及人源IgG抗體庫篩選；

抗體親和力成熟策略包括：隨機(jī)突變、定點(diǎn)突變等多種突變方式；

結(jié)合專有人類抗體數(shù)據(jù)庫、電子建模等技術(shù)。

CDR移植抗體構(gòu)建流程：

1.質(zhì)控

對客戶提供的親本抗體做活性驗證，確認(rèn)是否有必要進(jìn)行人源化改造。

2.抗體基因獲得

提取雜交瘤細(xì)胞中mRNA，反轉(zhuǎn)錄為cDNA，PCR擴(kuò)增VH和VL鏈，測序。

3.生物信息學(xué)方法設(shè)計人源化方案

3.1分析親本抗體VH和VL序列，進(jìn)行亞型分類、計算機(jī)模擬抗體結(jié)構(gòu)分析及多序列比對進(jìn)行CDR區(qū)和FR區(qū)定位，確定FR區(qū)保守氨基酸及關(guān)鍵氨基酸殘基及其位置。

a. V區(qū)、CDR及FR序列的確定

利用序列相似性搜索方法確定恒定區(qū)（CH和Cκ），然后找到序列引物，之間即為V區(qū)。將V區(qū)基因序列翻譯為氨基酸序列，通過Kabat數(shù)據(jù)庫和Swiss-Port數(shù)據(jù)庫比較，確定CDR和二硫鍵位置。

表： h-TNFα鼠單抗CDR和FR確定；*代表二硫鍵的Cys位置

b.抗體V區(qū)結(jié)構(gòu)同源建模及抗原抗體復(fù)合物模型構(gòu)建

（1）模板蛋白的選擇

利用PDB數(shù)據(jù)庫，搜索抗體V區(qū)同源蛋白，從而確定模板蛋白結(jié)構(gòu)和序列，如下圖。

（2）SCR和Loop區(qū)的確定

利用Structure Superimpose法對模板蛋白進(jìn)行結(jié)構(gòu)相似性分析，確定模板蛋白的結(jié)構(gòu)保守區(qū)（SCR）和無規(guī)則環(huán)區(qū)（Loop）。通過多序列比對，確定目的蛋白的SCR和Loop。

（3）抗體VH和VL初始結(jié)構(gòu)的獲得

（4）初始結(jié)構(gòu)構(gòu)象優(yōu)化及分子動力學(xué)模擬

首先用Insight Ⅱ(2000)中Rotamer軟件對模型構(gòu)象的二面角調(diào)整，再用Discovery軟件，在CVFF、Gromos力場下，經(jīng)陡下降、共軛梯度、牛頓力學(xué)等步驟對抗體V區(qū)構(gòu)象進(jìn)行優(yōu)化。再通過動力學(xué)優(yōu)化，獲得穩(wěn)定的空間構(gòu)象。見圖1。

圖：經(jīng)過分子模擬、力學(xué)優(yōu)化、動力學(xué)模擬獲得抗體VH和VL碳原子空間構(gòu)象

（5）抗體V區(qū)空間構(gòu)象合理性判斷

利用Ramachandran圖對獲得的抗體可變區(qū)構(gòu)象進(jìn)行評價，如下圖所示，不同顏色代表了氨基酸殘基構(gòu)象的合理程度。紅色代表殘基構(gòu)象匹配適宜，深黃色表示殘基構(gòu)象允許區(qū)，土黃色表示構(gòu)象可以，白色表示構(gòu)象存在較大誤差。

圖 利用Ramachandran圖對抗體的V區(qū)殘基進(jìn)行構(gòu)象評估

（5）抗體可變區(qū)Fv構(gòu)象的獲得

選擇同一個包含VH和VL的構(gòu)象的模板為參考，考慮VH和VL相互作用模式，分析可及性表面是和表觀靜電分布情況，利用Molecular Docking的方法獲得抗體V區(qū)構(gòu)象。

圖3 抗體可變區(qū)的空間構(gòu)象

（6）抗原-抗體復(fù)合物模型的建立

抗原-抗體相互作用復(fù)合物結(jié)構(gòu)是合理判定抗原表位、抗體合理改造與設(shè)計的基礎(chǔ)。利用Molecular Docking方法，探討抗原-抗體相互作用，確認(rèn)二者相互識別過程中靜電作用、氫鍵作用、疏水作用、范德華力作用等，預(yù)測二者的結(jié)合模式和親和能力，從而進(jìn)行抗原表位合理預(yù)測、抗體人源化和親和力改造。

圖   利用分子對接方法建立抗原-抗體復(fù)合物結(jié)構(gòu)模型

（7）抗體FR區(qū)中重要氨基酸殘基的確定

利用SAS方程，計算可及性表面積；利用Delphi程序，計算表觀靜電分布。基于以下原則確定抗體FR區(qū)中重要氨基酸殘基：

3.2通過Kabat、Genebank和IMGT等數(shù)據(jù)庫檢索比對和輔助計算機(jī)分子模擬，尋找大同源性的人FR區(qū)模板，設(shè)計CDR移植scFV，進(jìn)行計算機(jī)結(jié)構(gòu)模擬分析。

a. 人源抗體模板的選擇及FR區(qū)保守氨基酸的確定

在NCBI網(wǎng)站，運(yùn)行IgBLAST，通過BlastP程序，檢索人源庫中鼠抗體V區(qū)同源序列，通過序列比對歸納出人抗體FR中高頻率出現(xiàn)的氨基酸殘基及位置。

b. 鼠源抗體人源化過程中需要改變的殘基確定

根據(jù)可及表面積、表觀靜電分布及序列比對的結(jié)果，確定人源化過程中需要改變的氨基酸殘基。

c. 點(diǎn)突變的Fv空間結(jié)構(gòu)模擬

利用計算機(jī)建模、力學(xué)優(yōu)化及動力學(xué)模擬得到人源化抗體的V區(qū)構(gòu)象，通過結(jié)構(gòu)疊合進(jìn)行親本抗體和人源化抗體的構(gòu)象比較。

d. 人源化后抗體活性預(yù)測

借助Molecular Docking和動力學(xué)模擬優(yōu)化人源化后抗體-抗原復(fù)合物的結(jié)構(gòu)，通過相互作用能、分子間氫鍵以及識別表位，從理論上評價異源抗體人源化后的生物學(xué)活性。

3.3表達(dá)重構(gòu)抗體和親本scFV抗體

根據(jù)計算機(jī)模擬設(shè)計的人源化方案，合成基因，表達(dá)48-126個重構(gòu)抗體，分別測定其與抗原的相對結(jié)合活性。測定親本scFV抗體親和力，挑選親和力的人源化抗體克隆，進(jìn)行親和力成熟改造。