技術(shù)背景：

目前，藥用抗體的研發(fā)主要基于雜交瘤細(xì)胞或者體外抗體庫。通過抗原設(shè)計(jì)和抗體篩選，人們初步獲得陽性的hits，再進(jìn)一步通過一系列生物性質(zhì)檢測和功能驗(yàn)證，終得到有藥用潛力的抗體。在實(shí)際研發(fā)過程中，經(jīng)過了常規(guī)篩選所得的抗體，有諸多方面需要更細(xì)致的改進(jìn)，包括親和力、免疫原性、半衰期等等，抗體領(lǐng)域這些年來做了很多相關(guān)的研究和實(shí)踐。其中，抗體親和力成熟是研究的重要方向之一。理論上，抗體親和力的提高有助于改善抗體的特異性和效力，有助于減少用藥劑量，降低毒副作用等。雖然實(shí)際的研究證明親和力的提高與抗體效價(jià)的提高并不總是線性的關(guān)系，尤其在實(shí)體瘤的治療上（可參考Weinstein的“binding site barrier”假說[1]），但很多情況下，這個(gè)線性關(guān)系是明顯存在的。另外，發(fā)展抗體親和力成熟的技術(shù)，不僅有助于抗體藥物的研發(fā)和質(zhì)量改善，同時(shí)也有助于人們更好地理解抗體與靶點(diǎn)相互作用的機(jī)理，更好地認(rèn)識靶點(diǎn)的功能。

抗體親和力主要技術(shù)包括如下幾項(xiàng)：

1. 模擬體細(xì)胞高頻突變的抗體親和力成熟策略

BCR基因重排后的成熟B細(xì)胞受到抗原刺激后，會于生發(fā)中心發(fā)生重鏈和輕鏈V區(qū)的高頻率突變（主要是點(diǎn)突變），之后再經(jīng)過FDC捕獲抗原使表達(dá)高親和力BCR的B細(xì)胞免于凋亡。這一過程使得后代B細(xì)胞的BCR對抗原的平均親和力得到提升。這樣的體細(xì)胞高頻突變屬于二次免疫應(yīng)答，幫助可有效識別抗原的抗體進(jìn)一步成熟，有助于機(jī)體有效抵抗外來抗原的再次入侵。

抗體親和力成熟的策略之一，就是模擬體細(xì)胞高頻突變，通過細(xì)胞突變和展示抗體蛋白篩選對抗原高親和的抗體。原理如下圖：

1.1 基于B細(xì)胞系（人、雞等）高頻突變的篩選策略

Ramos是來源于人Burkitt淋巴瘤的一株細(xì)胞系，在培養(yǎng)過程中其重排后的免疫球蛋白V區(qū)基因持續(xù)發(fā)生組成型突變，并表達(dá)到膜表面。早在2002年Sarah等人就報(bào)道了利用Ramos細(xì)胞系篩選出對鏈霉親和素有高親和力的IgM。將鏈霉親和素結(jié)合到磁珠上，從一群Ramos細(xì)胞中篩出對鏈霉親和素有低親和力的細(xì)胞群，之后降低磁珠上的鏈霉親和素的密度以提高篩選的標(biāo)準(zhǔn)，進(jìn)一步篩出親和力更高的突變。之后又進(jìn)一步用標(biāo)記FITC熒光的鏈霉親和素結(jié)合流式分選將抗體親和力進(jìn)一步提高。

隨后，他們對各批次的亞克隆細(xì)胞的V區(qū)基因做了序列比對，找出了突變位點(diǎn)，分析了抗體與靶點(diǎn)之間的構(gòu)效關(guān)系。

同在這篇文章中，他們還嘗試了使用XRCC2缺失的雞來源的B細(xì)胞系（DT40），篩選針對多個(gè)抗原的高親和力IgM。該細(xì)胞系同樣具有高頻率的V區(qū)基因組成型突變，并且比Ramos細(xì)胞系增殖時(shí)間更短。篩選結(jié)果顯示該細(xì)胞系也能實(shí)現(xiàn)IgM的親和力成熟。

以上兩個(gè)例子說明合適的B細(xì)胞系可以作為工具細(xì)胞，用于抗體的親和力成熟。在具體應(yīng)用中，可以將特定的抗體模板基因插到細(xì)胞的免疫球蛋白基因位點(diǎn)，然后進(jìn)行細(xì)胞培養(yǎng)和高親和力細(xì)胞群的篩選。

1.2 基于其他細(xì)胞高頻突變的策略研究

基于體細(xì)胞高頻突變的抗體親和力成熟的開發(fā)，主流方法均是基于B細(xì)胞系。B細(xì)胞系有其自身的不足，如基因操作比較困難、蛋白的翻譯后修飾特點(diǎn)不能滿足所有外源蛋白的要求等等。于是有實(shí)驗(yàn)室嘗試在非B細(xì)胞系統(tǒng)上實(shí)現(xiàn)親和篩選，以擴(kuò)充該技術(shù)的細(xì)胞系選擇面。

如中科院生物物理所杭海英課題組，向人非小細(xì)胞肺癌細(xì)胞系H1299中導(dǎo)入激活誘導(dǎo)的胞苷脫氨酶（AID），構(gòu)建H1299-AID穩(wěn)轉(zhuǎn)株，然后進(jìn)一步導(dǎo)入抗TNF-α的scFv基因并構(gòu)建穩(wěn)轉(zhuǎn)株，得到的穩(wěn)轉(zhuǎn)株進(jìn)行培養(yǎng)和流式分選，獲取高親和力的scFv。

除此之外，還有基于非真核系統(tǒng)的篩選方法，如利用E. Coli的基因增變株來實(shí)現(xiàn)抗體基因的高頻突變等等，其原理大同小異。

2. 基于抗體庫的親和力成熟策略

基于抗體庫的抗體親和力成熟與基于抗體庫的抗體篩選并無本質(zhì)差別，均為體外高親和力抗體篩選，重點(diǎn)仍是兩個(gè)方面，即庫的構(gòu)建和篩選系統(tǒng)的選擇。區(qū)別在于，后者所用的庫在構(gòu)建或合成時(shí)無偏向性或只具有針對某抗原的有限的偏向性；而前者所用的庫是基于確定的抗體序列模板所構(gòu)建的。

2.1 建庫策略

建庫的策略可分為兩個(gè)大的類別：一類是構(gòu)建較大的庫，將抗體CDR區(qū)域甚至整個(gè)V區(qū)做隨機(jī)突變；另一類是構(gòu)建較小的庫，將突變集中于抗體序列上特定的區(qū)域。

大庫構(gòu)建的方法主要有CDR walking、chain shuffling、DNA shuffling等。CDR walking是指分段隨機(jī)突變并保證相鄰兩個(gè)突變區(qū)域有所重疊，從而使突變覆蓋整個(gè)CDR區(qū)域；chain shuffling是將抗體的VH和VL的配對重新洗牌，而DNA shuffling則是將抗體V區(qū)的序列重新洗牌。在DNA shuffling中，突變不限于CDR區(qū)，也包括FR區(qū)域，因?yàn)镕R區(qū)域?qū)τ诳贵w與抗原的結(jié)合也可能有所貢獻(xiàn)。這些方法所構(gòu)建的庫的容量較大，工作量也較大。

相比大庫的構(gòu)建，小庫構(gòu)建更有序列針對性。在沒有其他信息的情況下，人們習(xí)慣優(yōu)先選擇對抗體重鏈CDR3區(qū)域進(jìn)行隨機(jī)突變，因?yàn)橹劓淐DR3區(qū)域被認(rèn)為通常對抗原抗體結(jié)合起關(guān)鍵作用；但若要真正提高親和力優(yōu)化的效率，還需要更多的信息以幫助人們找出更精確的突變區(qū)域。

目前突變區(qū)域的選擇主要是基于抗原抗體復(fù)合物的結(jié)構(gòu)信息或胚系基因熱點(diǎn)（germline hotspots）的預(yù)測。

1）基于抗原抗體復(fù)合物的結(jié)構(gòu)信息的突變區(qū)域選擇

當(dāng)抗體抗原復(fù)合物的結(jié)構(gòu)被解析之后，我們就可以得知兩者相互作用的位點(diǎn)信息，進(jìn)而進(jìn)行更精確的突變和建庫。

MorphoSys AG2016年發(fā)的文章介紹了他們提高其自身的抗人GM-CSF抗體MOR103的親和力的工作。他們在知悉該抗體與抗原的結(jié)合方式后，對抗體的CDR-H2和CDR-L3分別做隨機(jī)突變，并用噬菌體展示的方法篩選到高親和力的序列，之后再把篩到的重鏈與輕鏈配對，得到一個(gè)新的“cross-cloned”抗體:

體外GM-CSF和GM-CSFR結(jié)合的抑制實(shí)驗(yàn)比較了這4個(gè)抗體的效價(jià)。另外，他們還分別解析了這4個(gè)抗體與GM-CSF結(jié)合的復(fù)合物的結(jié)構(gòu)并進(jìn)行比較，探討了構(gòu)效關(guān)系。

2）基于胚系基因熱點(diǎn)（germline hotspots）的突變區(qū)域選擇

Germline hotspots是體細(xì)胞高頻突變過程中的優(yōu)先突變區(qū)域，幾乎都處于CDR區(qū)域內(nèi)部，經(jīng)證明對抗體的親和力提高起到關(guān)鍵作用，因此體外親和力成熟時(shí)可優(yōu)先考慮抗體的germlinehotspots。

具體的做法是利用數(shù)據(jù)庫來比對抗體的序列和抗體胚系基因序列，結(jié)合序列相似度和RGYW motifs等坐標(biāo)性的序列預(yù)測出germline hotspots，然后在這些熱點(diǎn)位置進(jìn)行突變，構(gòu)建小的庫進(jìn)行篩選。早在2009年，Ira Pastan課題組就發(fā)表protocol，以抗CD22的單抗為例，利用germline hotspots預(yù)測和噬菌體展示技術(shù)提高抗體的親和力[5]。

至于引入突變的方法，較簡單的是易錯(cuò)PCR，但很難達(dá)到好的突變效果。另外一種比較流行的就是在引物上設(shè)計(jì)突變，即人工合成帶有突變區(qū)域的引物庫。具體的設(shè)計(jì)方法有很多，包括控制突變堿基的數(shù)目、控制每個(gè)位點(diǎn)各種堿基出現(xiàn)的概率等，以此來滿足對庫的容量和偏向性的需求。

2.2 篩選方法

基于庫的抗體親和力成熟與基于庫的抗體初步篩選涉及的方法基本相同，主要是利用噬菌體展示、酵母展示、核糖體展示等系統(tǒng)。

酵母展示技術(shù)

噬菌體展示的優(yōu)勢在于操作方便，流程相對簡易；

酵母展示的優(yōu)勢在于與流式分選相結(jié)合，檢測和篩選同時(shí)進(jìn)行；

核糖體展示的優(yōu)勢是系統(tǒng)容量較大，可用于大庫的篩選，另外可以實(shí)現(xiàn)庫的體外進(jìn)化。這些技術(shù)各有優(yōu)劣，根據(jù)實(shí)際需要選擇使用。

技術(shù)介紹：

根據(jù)抗體親合力成熟的原理，在體外抗體親和力成熟的過程中，選擇突變區(qū)域以及如何引入突變是一個(gè)關(guān)鍵問題，目前突變策略主要分三類：隨機(jī)突變，隨機(jī)突變，置換和定向突變。

易錯(cuò)PCR：

易錯(cuò)PCR是目前常用的抗體突變技術(shù)，可以在抗體基因的全場或部分區(qū)域隨機(jī)引入突變；在聚合酶對目的基因擴(kuò)增時(shí)；通過調(diào)整反應(yīng)條件以及使用錯(cuò)錯(cuò)配率高的聚合酶等，以一定的頻率向目的基因中隨機(jī)引入突變，經(jīng)過PCR反復(fù)進(jìn)行進(jìn)行隨機(jī)誘變，累計(jì)突變效應(yīng)，終獲得目的蛋白的隨機(jī)蛋白突變體。

鏈置換：

保留某個(gè)特定抗體的輕鏈或重鏈，另一條鏈與一個(gè)隨機(jī)化的互補(bǔ)鏈進(jìn)行組合，從中篩選更高活性的突變株。通過固定抗體兩條鏈中的一條鏈，對另一條鏈構(gòu)建具有足夠多樣性的置換文庫。隨機(jī)組合有可能產(chǎn)生合適鏈組合，通過噬菌體抗體庫篩選可獲得高親和力的抗體。

定點(diǎn)突變：

由于天然抗體在親和力成熟過程中，體細(xì)胞高頻突變發(fā)生區(qū)域并非均勻分布，而是主要集中在與抗原直接接觸的CDR區(qū)，在抗體的親和力體外成熟過程中，CDR去是常選用的定點(diǎn)突變區(qū)域，這樣既可以獲得足夠的祖列多樣性，又不會破壞蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)，對CDR進(jìn)行定點(diǎn)突變時(shí)，可以對多個(gè)CDR進(jìn)行平行突變或者逐步進(jìn)行優(yōu)化。

DNA改組：

DNA改組技術(shù)是對同源的抗體基因，采用脫氧核糖核苷酸酶Ⅰ將其切割成不超過50bp的片段，再隨機(jī)組合后進(jìn)行PCR擴(kuò)增成完整的抗體基因的技術(shù)，包含了抗體片段隨機(jī)化切割重組和篩選的過程，一定程度上模擬了天然抗體親和力成熟的過程，并加快了體外定向進(jìn)化速度。

公司優(yōu)勢：

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參考文獻(xiàn):

[1]Micropharmacology of monoclonal antibodies in solid tumors: directexperimental evidence for a binding sitebarrier. Cancer Research.

[2]Generation and iterative affinity maturation of antibodies in vitrousing hypermutating B cell lines. Nature Biotechnology.

[3]Affinity maturation ofanti-TNF-alpha scFv with somatic hypermutation innon-B cells. Protein Cell.

[4]Molecular basis of in vitro affinity maturation and functional evolutionof a neutralizing anti-human GM-CSF antibody.

[5]In Vitro Antibody Affinity Maturation Targeting Germline Hotspots. MethodsMolBiol